QC를 통해 low-quality cell을 제거한 뒤에는, 세포 간 sequencing depth 차이를 보정하고 downstream 분석에 중요한 variable genes를 선택하는 단계가 필요합니다. 이 단계는 PCA, clustering, annotation의 품질을 결정하는 핵심 과정입니다.

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A) 왜 normalization이 필요한가?

Single-cell RNA-seq에서는 각 세포마다 sequencing depth와 library size가 다를 수 있습니다. 따라서 raw count를 그대로 비교하면, 실제 biological difference가 아니라 단순히 더 많이 시퀀싱된 세포가 더 높은 발현을 가진 것처럼 보일 수 있습니다.

Normalization의 목적은 이러한 기술적 차이를 줄이고, 세포 간 발현값을 비교 가능한 형태로 변환하는 것입니다. 즉, normalization을 통해 실제 biological signal에 더 가깝게 데이터를 해석할 수 있습니다.

sequencing depth와 library size 차이를 보정하지 않으면 raw count 비교가 왜곡될 수 있습니다.

B) NormalizeData vs SCTransform

Seurat에서 가장 자주 사용하는 정규화 방법은 NormalizeData()와 SCTransform()입니다. NormalizeData()는 library size를 보정한 뒤 log transform을 적용하는 직관적이고 빠른 방법이며, 교육용 또는 기본 분석에 많이 사용됩니다.

반면 SCTransform()은 gene expression을 Negative Binomial model로 다루고, sequencing depth와 같은 기술적 변동을 회귀 기반으로 보정합니다. 일반적으로 더 정교한 정규화 방법으로 여겨지지만, 계산량이 많고 개념적으로 더 복잡합니다.

NormalizeData는 빠르고 직관적인 방식이며, SCTransform은 더 정교한 모델 기반 정규화 방법입니다.

C) Variable feature selection이 왜 중요한가?

모든 유전자를 그대로 downstream 분석에 사용하면, 변화가 거의 없는 housekeeping genes나 noise가 많은 유전자들이 함께 포함되어 PCA와 clustering 결과를 흐릴 수 있습니다.

따라서 세포 간 변동성이 큰 유전자들, 즉 highly variable genes (HVGs)를 선택하여 이후 차원 축소와 clustering에 사용하는 것이 일반적입니다. 이 과정은 biological signal을 더 잘 드러내고 계산 효율도 높여줍니다.

D) NormalizeData 수행

본 실습에서는 6개 샘플 각각에 대해 NormalizeData()를 적용합니다.

Copysample_list <- lapply(sample_list, function(obj) {
  NormalizeData(
    obj,
    normalization.method = "LogNormalize",
    scale.factor = 10000
  )
})

E) Variable feature selection 수행

정규화 후에는 각 샘플에서 변동성이 큰 유전자들을 선택합니다.

Copysample_list <- lapply(sample_list, function(obj) {
  FindVariableFeatures(
    obj,
    selection.method = "vst",
    nfeatures = 2000
  )
})

F) Variable features 시각화

아래는 ND1 샘플에서 variable feature를 확인하는 예시입니다.

CopyVariableFeaturePlot(sample_list[[1]])

상위 variable genes를 함께 표시하면 어떤 유전자들이 선택되었는지 더 쉽게 확인할 수 있습니다.

Copytop10 <- head(VariableFeatures(sample_list[[1]]), 10)

LabelPoints(
  plot = VariableFeaturePlot(sample_list[[1]]),
  points = top10,
  repel = TRUE
)

G) 모든 샘플에 대해 variable features 확인

실제 분석에서는 각 샘플마다 variable features의 분포가 다를 수 있으므로, 대표 샘플뿐 아니라 전체 샘플을 점검하는 것이 좋습니다.

Copyfor (nm in names(sample_list)) {
  print(
    VariableFeaturePlot(sample_list[[nm]]) + ggtitle(nm)
  )
}

H) 다음 단계로 넘길 객체 준비

이후 integration 또는 clustering 단계에서는 정규화와 variable feature selection이 완료된 객체를 사용합니다.

Copynames(sample_list)
head(VariableFeatures(sample_list[[1]]))

요약

• Normalization은 세포 간 sequencing depth 차이를 줄여 비교 가능한 값을 만드는 단계입니다.
• NormalizeData()는 빠르고 직관적이며, SCTransform()은 더 정교한 모델 기반 방법입니다.
• Variable feature selection은 downstream 분석에 중요한 유전자들을 선별하는 과정입니다.
• 본 실습에서는 6개 mouse CRC 샘플에 대해 NormalizeData와 FindVariableFeatures를 적용했습니다.

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