clustering으로 나뉜 세포 집단은 아직 번호만 붙은 상태입니다. Annotation 단계에서는 각 cluster의 marker gene를 확인하고, known biology와 reference 정보를 바탕으로 세포 유형(cell type)을 해석합니다.

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A) Annotation이란?

• cluster 번호(0, 1, 2, 3...) 자체는 biological 의미를 가지지 않습니다.
• 각 cluster에서 높게 발현되는 유전자(marker gene)를 보고 해당 cluster의 정체를 추정합니다.
• 예를 들어 CD3D, CD3E가 높으면 T cell, MS4A1이 높으면 B cell을 의심할 수 있습니다.
• 최종적으로는 “cluster 3”이 아니라 “T cells”, “Fibroblasts”, “Epithelial cells”처럼 이름을 붙이게 됩니다.

B) Cluster별 marker gene 찾기

Seurat에서는 FindAllMarkers()를 이용해 각 cluster에서 특이적으로 높은 유전자를 찾을 수 있습니다.

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markers <- FindAllMarkers(
  obj,
  only.pos = TRUE,
  min.pct = 0.25,
  logfc.threshold = 0.25
)

head(markers)

결과 테이블에는 보통 cluster 번호, gene 이름, average log fold change, 발현 비율 등이 포함됩니다.

C) 대표 marker 확인

각 cluster의 상위 marker를 확인하여 어떤 세포 유형인지 추정할 수 있습니다.

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library(dplyr)

top10 <- markers %>%
  group_by(cluster) %>%
  slice_max(order_by = avg_log2FC, n = 10)

top10

D) 시각화로 marker 확인하기

Annotation에서는 표만 보는 것이 아니라, 반드시 시각화와 함께 확인하는 것이 좋습니다.

D-1) FeaturePlot

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FeaturePlot(obj, features = c("CD3D", "MS4A1", "EPCAM", "COL1A1"))

D-2) DotPlot

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DotPlot(
  obj,
  features = c("CD3D", "CD79A", "EPCAM", "COL1A1", "PECAM1", "LYZ")
) + RotatedAxis()

D-3) VlnPlot

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VlnPlot(obj, features = c("CD3D", "MS4A1", "EPCAM"), ncol = 3)

marker gene 발현 패턴을 바탕으로 cluster의 biological identity를 해석합니다.

E) 자주 쓰이는 대표 marker 예시

F) Cluster 이름 바꾸기

해석이 끝나면 cluster 번호를 실제 cell type 이름으로 바꿀 수 있습니다.

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new.cluster.ids <- c(
  "T cells",
  "B cells",
  "Myeloid cells",
  "Epithelial cells",
  "Fibroblasts",
  "Endothelial cells"
)

names(new.cluster.ids) <- levels(obj)
obj <- RenameIdents(obj, new.cluster.ids)

DimPlot(obj, reduction = "umap", label = TRUE)

cluster 수와 이름 개수는 반드시 일치해야 합니다.

G) Metadata에 annotation 저장

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obj$celltype <- Idents(obj)

head(obj@meta.data)
DimPlot(obj, group.by = "celltype", label = TRUE)

H) Reference-based annotation

수동 annotation 외에도 reference dataset을 사용하여 annotation을 보조할 수 있습니다. 대표적으로 SingleR 같은 도구가 자주 사용됩니다.

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library(SingleR)
library(celldex)

ref <- HumanPrimaryCellAtlasData()

pred <- SingleR(
  test = GetAssayData(obj, slot = "data"),
  ref = ref,
  labels = ref$label.main
)

head(pred$labels)

I) 실습용 전체 코드 예시

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# marker gene 찾기
markers <- FindAllMarkers(
  obj,
  only.pos = TRUE,
  min.pct = 0.25,
  logfc.threshold = 0.25
)

# 상위 marker 확인
library(dplyr)
top10 <- markers %>%
  group_by(cluster) %>%
  slice_max(order_by = avg_log2FC, n = 10)

top10

# 시각화
FeaturePlot(obj, features = c("CD3D", "MS4A1", "EPCAM", "COL1A1"))
DotPlot(obj, features = c("CD3D", "CD79A", "EPCAM", "COL1A1", "PECAM1", "LYZ")) + RotatedAxis()

# cluster 이름 변경
new.cluster.ids <- c("T cells", "B cells", "Myeloid cells", "Epithelial cells", "Fibroblasts", "Endothelial cells")
names(new.cluster.ids) <- levels(obj)
obj <- RenameIdents(obj, new.cluster.ids)

# metadata 저장
obj$celltype <- Idents(obj)

# 최종 시각화
DimPlot(obj, group.by = "celltype", label = TRUE)

J) 해석 시 주의점

• 하나의 marker만으로 세포 유형을 단정하지 않는 것이 좋습니다.
• marker는 tissue context와 disease context에 따라 다르게 나타날 수 있습니다.
• 같은 cell type 안에서도 activation state, cell cycle, differentiation state에 따라 subgroup가 존재할 수 있습니다.
• annotation은 clustering 결과를 biological language로 번역하는 과정이므로, 결과를 반복적으로 점검해야 합니다.

요약

• Annotation은 cluster를 실제 biological identity로 해석하는 과정입니다.
• FindAllMarkers()로 cluster별 marker gene를 찾을 수 있습니다.
• FeaturePlot, DotPlot, VlnPlot으로 marker 발현을 시각화해 확인합니다.
• 수동 annotation과 reference-based annotation을 함께 활용하면 더 안정적인 해석이 가능합니다.

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