Step 06. Variant Annotation

변이(VCF)를 유전자/단백질 영향, 인구 빈도, 임상 DB 정보로 주석(annotation)합니다. 이 가이드는 Funcotator(GATK) 중심이며, 대안으로 VEP, SnpEff도 간단히 소개합니다.

A) 왜 주석이 필요한가?

• 생물학적 영향: 유전자/전사체/아미노산 변화(예: p.G12D), 예측 영향.
• 인구 빈도: gnomAD/1KGP 등(희귀/공통 구분).
• 임상 지식: ClinVar, COSMIC 등.
• 다운스트림: 필터링·우선순위·리포팅(예: MAF 생성 후 maftools/OncoPrint 등).

B) 공통 변수 & 경로

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# 스레드 & 레퍼런스
THREADS=20
REF_DIR="/home/kang/raw_data/gatk_bundle/v0"
REF="${REF_DIR}/Homo_sapiens_assembly38.fasta"

# 입력(05단계 출력)
VAR_IN="/home/kang/God_Nas/WGS_2nd/variant"     # *.filtered.vcf.gz

# 출력
ANN_OUT="/home/kang/God_Nas/WGS_2nd/annotation"
mkdir -p "${ANN_OUT}"

# Funcotator 데이터소스(로컬 위치로 수정)
FUNC_DS="/home/kang/raw_data/gatk_bundle/dataSourcesFolder/funcotator_dataSources.v1.7.20200521s/"

C) 주석 전 정규화(권장)

인델의 left-align 및 multi-allelic 분리는 주석 정확도를 높입니다.

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# 예: NP-21.filtered.vcf.gz → 정규화
SAMPLE="NP-21"
bcftools norm -f "${REF}" -m -both \
  -O z -o "${ANN_OUT}/${SAMPLE}.normalized.vcf.gz" \
  "${VAR_IN}/${SAMPLE}.filtered.vcf.gz"
tabix -p vcf "${ANN_OUT}/${SAMPLE}.normalized.vcf.gz"

D) Funcotator (권장)

D-1) Somatic(종양) 결과를 MAF로

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SAMPLE="NP-21"

gatk Funcotator \
  -R "${REF}" \
  -V "${ANN_OUT}/${SAMPLE}.normalized.vcf.gz" \
  -O "${ANN_OUT}/${SAMPLE}.funcotated.maf.gz" \
  --output-file-format MAF \
  --data-sources-path "${FUNC_DS}" \
  --ref-version hg38 \
  --annotation-default tumor_barcode:${SAMPLE}

D-2) Germline VCF을 주석(VCF 유지)

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SAMPLE="Family01_Proband"

gatk Funcotator \
  -R "${REF}" \
  -V "${ANN_OUT}/${SAMPLE}.normalized.vcf.gz" \
  -O "${ANN_OUT}/${SAMPLE}.funcotated.vcf.gz" \
  --output-file-format VCF \
  --data-sources-path "${FUNC_DS}" \
  --ref-version hg38
tabix -p vcf "${ANN_OUT}/${SAMPLE}.funcotated.vcf.gz"

E) 배치 실행 스크립트 (Somatic → MAF)

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#!/usr/bin/env bash
set -euo pipefail
THREADS=20
REF="/home/kang/raw_data/gatk_bundle/v0/Homo_sapiens_assembly38.fasta"
VAR_IN="/home/kang/God_Nas/WGS_2nd/variant"
ANN_OUT="/home/kang/God_Nas/WGS_2nd/annotation"
FUNC_DS="/home/kang/raw_data/gatk_bundle/dataSourcesFolder/funcotator_dataSources.v1.7.20200521s/"
mkdir -p "${ANN_OUT}"

shopt -s nullglob
for VCF in "${VAR_IN}"/*.filtered.vcf.gz; do
  SAMPLE="$(basename "${VCF}" .filtered.vcf.gz)"
  echo "[NORM] ${SAMPLE}"
  bcftools norm -f "${REF}" -m -both -O z -o "${ANN_OUT}/${SAMPLE}.normalized.vcf.gz" "${VCF}"
  tabix -p vcf "${ANN_OUT}/${SAMPLE}.normalized.vcf.gz"

  echo "[FUNCOTATOR] ${SAMPLE}"
  gatk Funcotator -R "${REF}" \
    -V "${ANN_OUT}/${SAMPLE}.normalized.vcf.gz" \
    -O "${ANN_OUT}/${SAMPLE}.funcotated.maf.gz" \
    --output-file-format MAF \
    --data-sources-path "${FUNC_DS}" \
    --ref-version hg38 \
    --annotation-default tumor_barcode:${SAMPLE}
done
echo "All annotations written to: ${ANN_OUT}"

F) MAF 주요 컬럼 한눈에

G) 대안: VEP / SnpEff (요약)

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# 예시: VEP VCF → VCF
vep -i input.vcf.gz -o output.vep.vcf.gz --vcf \
  --cache --offline --assembly GRCh38 \
  --dir_cache /path/to/vep_cache \
  --fork 20 --compress_output bgzip
tabix -p vcf output.vep.vcf.gz

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# 예시: SnpEff
snpEff -v GRCh38.99 input.vcf.gz | bgzip -c > output.snpeff.vcf.gz
tabix -p vcf output.snpeff.vcf.gz

H) 자주 하는 실수 & 팁

• 빌드/전사체 불일치: hg19 vs hg38, RefSeq vs Gencode 혼용 금지.
• 정규화 생략: 인델 left-align, multi-allelic 분리를 먼저 수행.
• 복수 전사체: 보고 기준(대표 전사체)을 프로젝트 차원에서 고정.
• 임상 DB 최신성: ClinVar/COSMIC 등은 버전 의존. 리포트 시 버전 명기.